Стрельников

На правах рукописи


СТРЕЛЬНИКОВ

Владимир Викторович


Всеохватывающее исследование метилотипов злокачественных новообразований:

фундаментальные и прикладные нюансы


03.02.07 - генетика


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора био наук


Москва - 2012

Работа выполнена в Федеральном муниципальном экономном учреждении «Медико-генетический научный центр» Русской академии мед наук


^ Научный Стрельников консультант:

доктор био наук, доктор Залетаев Дмитрий Владимирович


Официальные оппоненты:

Носиков Валерий Вячеславович, доктор био наук, доктор

Федеральное государственное экономное учреждение науки «Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля» Русской академии, заведующий лабораторией постгеномных молекулярно Стрельников-биологических исследовательских работ


^ Фаворова Ольга Олеговна, доктор био наук, доктор

Государственное экономное образовательное учреждение высшего проф образования «Российский государственный исследовательский мед институт имени Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения и общественного развития Стрельников Русской Федерации, заведующая кафедрой молекулярной биологии и мед биотехнологии


^ Иващенко Татьяна Эдуардовна, доктор био наук, доктор

Федеральное государственное экономное учреждение «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта" Северо-Западного Стрельников отделения Русской академии мед наук (Санкт-Петербург), ведущий научный сотрудник лаборатории пренатальной диагностики прирожденных и наследных болезней


^ Ведущая организация:

Государственное экономное образовательное учреждение высшего проф образования 1-ый Столичный муниципальный мед институт имени И Стрельников.М. Сеченова Министерства здравоохранения и общественного развития Русской Федерации


Защита состоится «___» _______ 2012 г. в ___ часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном муниципальном экономном учреждении «Медико-генетический научный центр» Русской академии мед наук (115478, Москва Стрельников, ул. Москворечье, 1)


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального муниципального экономного учреждения «Медико-генетический научный центр» Русской академии мед наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.


Автореферат разослан «______»___________________ 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного Стрельников совета Д 001.016.01

по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор мед наук, доктор Зинченко Рена Абульфазовна
^ I. ОБЩАЯ Черта РАБОТЫ
Актуальность задачи. Значимая часть современных представлений о злокачественных новообразованиях основывается на предположении о Стрельников том, что они развиваются в итоге выхода клеток из-под контроля устройств регуляции роста, деления и дифференцировки вследствие скопления соматических мутаций (Hanahan D., Weinberg R.A., 2000; Stratton M.R. et al., 2009). Наличие соматических мутаций Стрельников, в число которых входят как структурные повреждения (нуклеотидные подмены, маленькие инсерции и делеции, хромосомные перестройки, численные аномалии), так и эпигенетические нарушения, – неотъемлемое свойство геномов всех клеток злокачественных новообразований (Pleasance E.D Стрельников. et al., 2010).

Новые технологии полногеномного анализа ДНК позволяют определять фактически все классы структурных соматических конфигураций на всем протяжении генома (Mardis E.R. et al., 2009; Beroukhim R. et al., 2010). Полногеномный анализ структурных конфигураций, основанный Стрельников на способах секвенирования последнего поколения, обеспечивает получение результатов с точностью до 1-го нуклеотида. Практически предстоящее развитие этой области исследования соматических мутаций в последнее время будет сводиться к совершенствованию имеющихся технологий (Ding Стрельников L. et al., 2010; Lee W. et al., 2010).

К полногеномному анализу метилирования ДНК способы секвенирования последнего поколения на сегодня применимы в очень малозначительной степени, что разъясняется сначала сниженной информативностью последовательностей бисульфит-модифицированной ДНК, применяемой Стрельников в качестве матрицы для секвенирования (Stratton M.R. et al., 2009). Неметилированные участки ДНК после бисульфитной конверсии представляют собой последовательности из 3-х нуклеотидов, что существенно осложняет выравнивание фрагментов при формировании контигов Стрельников; не считая того, прямые и оборотные чтения конвертированной ДНК не являются назад комплементарными (Tost J., Gut I.G., 2007; Xi Y., Li W., 2009; Huss M. 2010). Таким макаром, достоверная информация о нраве метилирования ДНК Стрельников с однонуклеотидным разрешением на сегодня может быть получена только с внедрением обычных способов локус-специфического анализа, воплощение которого просит формирования принципов отбора кандидатных геномных локусов.

При разработке стратегия отбора кандидатных локусов для детализированной свойства Стрельников метилирования следует принять во внимание все имеющиеся способности скрининга черт эпигеномов. Подходы к таким исследованиям не универсальны. Одни из их обеспечивают анализ с полногеномным покрытием, но низким разрешением; другие, при Стрельников высочайшем разрешении, позволяют рассматривать ограниченные подборки участков генома.

К первой группе относятся способы, основанные или на аффинном обогащении фрагментированной ДНК фракциями с определенными эпигенетическими чертами, или на обработке препаратов ДНК разными типами нуклеаз Стрельников. Таким макаром можно проанализировать не только лишь метилирование ДНК (Weber M. et al., 2005), да и хим модификации хроматина - гистоновые метки H3K4Me1, H3K27Ac, H3K4Me3 (Heintzman Стрельников N. D. et al., 2009), области доступного хроматина (Crawford G.E. et al., 2006; Boyle A.P. et al., 2008), плотность нуклеосомной упаковки (Dennis J.H. et al., 2007). Накрепко определяя эпигенетические конфигурации на полногеномном уровне, обозначенные способы Стрельников мучаются низкой прецизионностью: исследуемые характеристики характеризуются с разрешением около 100-200 нуклеотидных пар (Huebert D.J. et al., 2006; Crawford G.E. et al., 2006; Johnson D.S. et al., 2008; Serre D. et al Стрельников., 2009).

2-ая группа подходов предполагает скрининг дифференциального метилирования ограниченных выборок геномных локусов. В этой группе более известны способы метилчувствительного рестрикционно-ориентированного геномного сканирования (Rush L.J. et al., 2001; Costello J.F. et al., 2009), метилчувствительного репрезентативно-дифференциального Стрельников анализа (Ushijima T. et al., 1997), метилчувствительного фингерпринтинга (Gonzalgo M.L. et al., 1997), амплификации интерметилированных веб-сайтов (Frigola J. et al., 2002). Большущим преимуществом перечисленных способов является непредвзятость скрининга, под которой Стрельников понимается определение дифференциального метилирования заблаговременно неведомых локусов генома с следующей идентификацией их нуклеотидных последовательностей (Fraga M.F., Esteller M., 2002). Непредвзятый скрининг расширяет фундаментальные представления о роли метилирования ДНК в норме и при Стрельников патологии, и содействует диверсификации основ разработки эпигенетических исследовательских маркеров. Непредвзятость скрининга - краеугольный камень беспристрастной оценки состояния изучаемых метиломов (Schumacher A. et al., 2006, Gebhard et al., 2006). В то же время рационального способа непредвзятого скрининга Стрельников дифференциального метилирования на сегодня не существует (Bock, C., 2009). Обозначенные способы, разработанные более 10 годов назад, так и не отыскали широкого внедрения. Требуется формирование принципно новейшей концепции, учитывающей современный уровень генетических познаний и использующей Стрельников достоинства окончания проекта по секвенированию генома человека.

Сравнение результатов исследования полногеномного и локального метилирования ДНК и ряда черт хроматина в границах хромосомных участков должно привести к формированию синтетического подхода к исследованию метиломов злокачественных новообразований Стрельников, который будет полезен как исходя из убеждений исследования базовых основ эпигенетической регуляции при канцерогенезе, так и исходя из убеждений разработки молекулярно-генетических клинических исследовательских маркеров. Применительно к базовым и прикладным нюансам Стрельников онкогеномики требуется разработка методологии анализа эпигеномов злокачественных новообразований на базе синтеза современных способов молекулярной генетики, мед биотехнологии, математического моделирования и биоинформатики.

^ Цель работы. Создать необычную методологию скрининга дифференциального метилирования геномов и применить её Стрельников к исследованию базовых черт метиломов злокачественных новообразований.

^ Задачки исследования.

  1. Создать необычную методологию непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов на базе синтеза современных способов молекулярной генетики, математического моделирования и биоинформатики.

  2. Охарактеризовать состав Стрельников репрезентаций генома, генерируемых разработанными способами скрининга районов дифференциального метилирования геномов.

  3. Идентифицировать новые гены и локусы, вовлеченные в канцерогенез и подверженные аномальной эпигенетической регуляции при раке.

  4. Провести анализ молекулярной патологии более многообещающего Стрельников гена-кандидата на роль супрессора опухолевого роста из набора новых генов, выявленных в процессе исследования.

  5. Идентифицировать постоянно метилированные участки генома человека, которые могут служить основой для обоснованного дизайна контролей эффективности метилчувствительной ПЦР.

  6. Охарактеризовать Стрельников локальные характеристики хроматина, определяющие состояние метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе.

  7. Сформировать синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез, на базе локальных черт Стрельников генома в норме и при злокачественной трансформации.

  8. Используя разработанный метод пророчества статуса метилирования участков генов, вовлеченных в канцерогенез, провести исследования эпигенетической патологии всех генов, кодирующих семейство белков, конкретно вовлеченных в процессы канцерогенеза Стрельников (12 генов субъединиц ламининов).

^ Научная новизна.

Разработана уникальная методология непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов AFLOAT (анализ, направленный на длину амплифицируемых фрагментов). Предложены принципные модификации способов поиска дифференциального метилирования – метилчувствительного фингерпринтинга и амплификации интерметилированных веб-сайтов Стрельников (АИМС). Охарактеризован состав репрезентаций генома, генерируемых способами метилчувствительного фингерпринтинга и АИМС. Выявлено 26 новых локусов, дифференциально метилированных в опухолях, условно обычных тканях молочной железы, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы Стрельников. Из их 22 принадлежат генам ^ LAMB1, RAI1, KCNH8, DOCK6, GPC2, SH3KBP1, PPP2R5C, PHF1, ATMIN, C2CD2, KIAA1324L, IQSEC2, AX746725/AK127124, TMEM176A/TMEM176B, FOXM1/HKMT1188, LAMC Стрельников3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Четыре дифференциально метилированных района размещены в межгенных областях на хромосомах 1p33, 5p15.33, 12q13.13 и 13q32.1. Проведена оценка частот аномального метилирования обозначенных локусов. Особенности метилирования выявленных областей Стрельников охарактеризованы в первый раз. Анализ молекулярной патологии гена SEMA6B, аномальное метилирование которого при раке молочной железы в первый раз показано в реальном исследовании, показал наличие повреждений гена (метилирование, утрата гетерозиготности) в 75% образцов Стрельников рака молочной железы (РМЖ). В первый раз выявлена герминальная мутация SEMA6B у пациентки с РМЖ. Приобретенные результаты свидетельствуют о том, что SEMA6B – один из более реальных генов-кандидатов на роль Стрельников супрессора опухолевого роста в области 19р13.3.

Скрининг метилирования ДНК из образцов рака молочной железы, светлоклеточного рака почки, рака мочевого пузыря, прилежащих условно обычных тканей, аутопсийного материала молочной железы, лимфоцитов периферической крови Стрельников и буккального эпителия здоровых доноров в первый раз выявил постоянно метилированные участки генома человека, принадлежащие CpG-островку гена CUX1 в составе альтернативного 3’-концевого экзона, первым экзонам генов LAMA3A, LAMB3, LAMC3, интронным Стрельников областям генов MAD1L1, TAF4 и 3'-CpG-островку гена ZBTB4.

В первый раз проведено исследование эпигенетической патологии всех генов, кодирующих семейство белков, конкретно вовлеченных в процессы канцерогенеза (12 генов цепей ламининов). 6 из Стрельников их показывают неметилированное состояние в обычных тканях и аномальное метилирование при РМЖ, с частотами, составившими для генов LAMA1 – 36%, LAMA2 – 38%, LAMA3B – 6%, LAMA4 – 2%, LAMB1 – 16%, LAMC3 – 8%. Промотор гена LAMC2 показал дифференциальное метилирование зависимо от тканевого Стрельников происхождения образцов: в буккальном эпителии и лимфоцитах периферической крови метилирование отсутствует, в то время как эталоны ДНК из обычных и опухолевых тканей молочной железы метилированы в 100% случаев. Постоянное метилирование предсказано и доказано Стрельников для промоторных областей 2-ух генов субъединиц ламининов – LAMA3A и LAMB3.

В первый раз проведенный прицельный анализ состояния метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе зависимо от локальных черт хроматина показал совместное Стрельников размещение постоянно метилированных участков с плотной упаковкой нуклеосом при закрытом хроматине, постоянно неметилированных участков – с низкой плотностью упаковки нуклеосом при закрытом хроматине, и дифференциально метилированных участков – с областями открытого Стрельников хроматина при хоть какой плотности нуклеосомной упаковки.

^ Теоретическая и практическая значимость.

Разработанные системы скрининга дифференциального метилирования геномов высоко воспроизводимы, тщательно охарактеризованы и могут быть применены в предстоящем в работах по характеристике эпигенетических Стрельников нарушений, ассоциированных с социально важными болезнями. Решена основная неувязка непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов – определение геномной принадлежности дифференциально метилированных локусов. Благодаря созданию новейшей технологии анализа, нацеленного на длину амплифицируемых фрагментов, AFLOAT, из Стрельников процедуры определения геномной принадлежности локусов стопроцентно исключается многоэтапный блок лабораторного анализа - выделение фрагментов ДНК из гелей, их реамплификация, клонирование, экстракция плазмидной ДНК и секвенирование. Предложенные способы скрининга обеспечивают высшую воспроизводимость результатов, понижение токсичности Стрельников, себестоимости и трудозатратности исследовательских работ, расширение способностей зрительного контроля на каждом шаге опыта. По результатам свойства состава репрезентаций генома, генерируемых способами метилчувствительного фингерпринтинга и АИМС, предложены схемы тестов, обеспечивающие высочайшее содержание CpG-островков Стрельников в составе репрезентаций дифференциально метилированных участков, что обеспечивает базу для действенного выявления новых генов и локусов, вовлеченных в канцерогенез и подверженных аномальной эпигенетической регуляции при раке. Выявленные постоянно метилированные участки генома Стрельников человека обеспечивают проведение обоснованного дизайна контролей эффективности метилчувствительной ПЦР. Результаты проведенного анализа геномных локусов и сформулированный синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов с учетом локальных черт хроматина Стрельников представляют собой базу для разработки исследовательских систем эпигенетических маркеров. Разработанные методы, способы и компьютерные программки оформлены в виде рекламно-технических описаний и описания новейшей мед ДНК-технологии, прошедших муниципальную регистрацию. Зарегистрирована заявка на Стрельников патент «Способ формирования панелей маркеров метилирования ДНК».

^ Главные положения, выносимые на защиту.

  1. Разработаны методы, протоколы и компьютерные программки для проведения метилчувствительного фингерпринтинга и анализа, нацеленного на длину амплифицируемых фрагментов (AFLOAT), обеспечивающие увеличение воспроизводимости Стрельников результатов, понижение себестоимости и трудозатратности исследовательских работ, расширение способностей зрительного контроля на каждом шаге опыта.

  2. Разработаны уникальные подходы к картированию дифференциально метилированных локусов, решающие основную делему непредвзятого скрининга дифференциального Стрельников метилирования геномов – определение геномной принадлежности выявляемых фрагментов ДНК.

  3. Охарактеризован состав репрезентаций генома, генерируемых способами метилчувствительного фингерпринтинга и AFLOAT. Предложены схемы тестов, обеспечивающие высочайшее содержание CpG-островков в составе репрезентаций дифференциально метилированных участков Стрельников.

  4. Уникальные способы непредвзятого скрининга позволяют идентифицировать дифференциально метилированные локусы геномов независимо от их расположения относительно кодирующих областей, промоторов и веб-сайтов инициации транскрипции, что подтверждает непредвзятый нрав скрининга.

  5. Анализ молекулярной патологии гена SEMA Стрельников6B, аномальное метилирование которого при раке молочной железы в первый раз показано в реальном исследовании, свидетельствуют о том, что это один из более реальных генов-кандидатов на роль супрессора опухолевого роста в Стрельников области хромосомы 19р13.3.

  6. Выявлены постоянно метилированные участки генома человека, предоставляющие базу для обоснованного дизайна контролей эффективности метилчувствительной ПЦР.

  7. Предложена догадка, связывающая локальные свойства хроматина и состояние метилирования участков ДНК в норме и Стрельников при канцерогенезе. На её базе разработан синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез.

  8. Показан высочайший предиктивный потенциал разработанной системы отбора для анализа метилирования кандидатных участков Стрельников генов, на примере исследования эпигенетической патологии семейства генов ламининов.

^ Апробация работы.

Материалы исследования были доложены на конференции ГНТП "Геном человека" в 2000 г., каждогодних конференциях Евро общества генетики человека в 2002, 2004, 2005, 2006 (диплом и премия), 2007, 2008 и 2009 гг Стрельников., научно-практическом симпозиуме "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" в 2002 г., 97-й каждогодней конференции Южноамериканского общества исследования рака (Вашингтон, 2006; премия), V и VI Интернациональных конференциях «Молекулярная медицина и биобезопасность» (г. Москва) в Стрельников 2008 и 2009 гг., V и VI съездах Русского общества мед генетиков (Уфа, 2009 и Ростов-на-Дону, 2010), V конференции юных ученых Рф с интернациональным ролью «Фундаментальные науки и прогресс медицинской медицины» (г. Москва Стрельников) в 2008 г., V и VI Столичном международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в 2009 и 2011 гг., 6-м симпозиуме “Био базы терапии онкологических и гематологических болезней” (г. Москва) в 2009 г., конференции юных ученых, посвященной Стрельников 40-летию МГНЦ РАМН (г. Москва) в 2009 г., Глобальном эпигенетическом конгрессе (г. Берлин) в 2009 г., 11-й и 12-й Европейских конференциях по цитогенетике и молекулярной генетике приличных опухолей (г. Бильбао, 2008 и г Стрельников. Неймеген, 2010).

Разработанные методы, новые мед технологии и компьютерные программки были применены при выполнении научно-исследовательских работ по гранту РФФИ № 08-04-01685 «Общие закономерности структурно-функциональной организации эпигеномов клеток рака молочной железы», по муниципальному договору Стрельников № 8/3-655н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и черта новых молекулярных маркеров для ранешней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности исцеления рака мочевого пузыря», по муниципальному договору № 8/3-657н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и черта новых молекулярных маркеров для ранешней Стрельников диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности исцеления рака почки», по муниципальному договору № 02.740.11.0089 от 15 июня 2009 в рамках федеральной мотивированной программки «Научные и научно-педагогические кадры инноваторской России» на 2009-2013 годы по теме «Разработка новых исследовательских Стрельников технологий на базе устройств эпигенетической регуляции», по гранту Earlier Breast Cancer Test Foundation “Development and validation of a differential methylation screening technology applicable for the identification of early breast cancer diagnostic Стрельников markers” (2007-2010 гг.).

^ Личный вклад создателя.

Создателем разработаны план исследования и базы методологии анализа метилирования ДНК, изложенные в работе, предложены главные модификации способов и протоколов скрининга метилирования ДНК (90%). Постановка и апробация всех новых Стрельников способов проведены создателем лично. Осуществлен дизайн 100 из 112 олигонуклеотидных праймеров для проведения ПЦР (90%). Выделение образцов ДНК и практическое исследование метилотипов разных типов злокачественных новообразований проведено вместе с сотрудниками из лаборатории эпигенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН Стрельников. Проведен анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, приобретенных в итоге скрининга дифференциального метилирования, с внедрением компьютерных программ и доступных баз данных метилирования ДНК, сформированы детальные карты метилирования соответственных геномных локусов (100%). Охарактеризованы локальные характеристики хроматина Стрельников, определяющие состояние метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе (100%). Сформирован синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез, на базе локальных черт генома в норме Стрельников и при злокачественной трансформации (100%).

Публикации. По теме диссертационного исследования размещено 66 печатных работ, в том числе 21 статья в журнальчиках, рекомендованных ВАК Минобрнауки для опубликования главных научных результатов диссертации на соискание ученой степени Стрельников доктора био наук, 8 глав в учебниках, 3 статьи в сборниках и коллективных монографиях, 28 тезисов, зарегистрированы 2 новые мед ДНК-технологии, 3 рекламно-технических описания компьютерных программ, 1 заявка на получение патента.

^ Структура и объем Стрельников диссертации. Диссертация изложена на 238 страничках машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и способы), описания результатов и их обсуждения, выводов и перечня цитируемой литературы, включающего 216 ссылок. Диссертация иллюстрирована 24 таблицами Стрельников и 98 рисунками.


^ II. МАТЕРИАЛЫ И Способы

Материал для исследования.

Эталоны тканей опухолей молочной железы и прилежащих морфологически обычных тканей получены от 270 нездоровых РМЖ, 100 нездоровых раком почки (РП), 55 нездоровых раком мочевого пузыря (РМП) и 54 нездоровых Стрельников немелкоклеточным раком легких (НМРЛ), прооперированных в ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН, Урологической поликлинике им. Р.М. Фронштейна ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития Рф, ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический Стрельников институт имени П.А. Герцена» Минздравсоцразвития Рф, ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» Минздравсоцразвития Рф. Гистологическую идентификацию тканей проводили в отделе патоморфологии опухолей НИИ медицинской онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН Стрельников, отделе патоморфологии ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена» Минздравсоцразвития Рф и в патологоанатомическом отделении ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития Рф, где были получены серийные срезы замороженных образцов опухолевых Стрельников и прилежащих обычных тканей. Эталоны периферической крови и буккального эпителия 90 нездоровых В-клеточным острым лимфобластным лейкозом (В-ОЛЛ) получены в ФНКЦ Детской гематологии, онкологии и иммунологии" Росздрава и ФГБУ "Гематологический научный центр Стрельников" Минздравсоцразвития Рф. Диагноз В-ОЛЛ был поставлен и доказан с внедрением стандартного набора способов: общего анализа крови с подсчетом лейкоцитарной формулы, микроскопичного и цитохимического исследования мазков костного мозга, иммунофенотипирования бластных клеток, цитогенетического Стрельников обследования. Клеточные полосы РМЖ ZR-75-1, HBL-100, HS 578 T, BT-474, T-47D и MCF7 предоставлены Федеральным муниципальным экономным учреждением науки Институтом биологии гена РАН. Эталоны крови обычных доноров предоставлены донорским пт ГБОУ ВПО Первого МГМУ Стрельников им. И.М. Сеченова (150 образцов). Эталоны буккального эпителия (7 образцов) разлюбезно предоставлены сотрудниками лаборатории эпигенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН.

^ Экстракция и анализ геномной ДНК.

Материалом для молекулярных исследовательских работ послужила геномная ДНК, выделенная из Стрельников цельной крови и образцов приличных тканей стандартным способом фенол-хлороформной экстракции (Johns M.B.Jr., Paulus-Thomas J.E., 1989). Обработку ДНК бисульфитом натрия и следующую метилспецифическую ПЦР проводили в Стрельников согласовании с без помощи других разработанной и зарегистрированной ДНК-технологией (Стрельников В.В. с соавт., Разрешение ФС № 2011/134 от 27.05.2011 г.). Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции и лигирование фрагментов ДНК проводили по протоколам фирмы-производителя Стрельников ферментов («Сибэнзим», Наша родина). Метилчувствительную ПЦР проводили по схеме, разработанной создателем (Strelnikov V.V.et al., 1999). Для анализа метилирования импринтированных генов применяли свою ДНК-технологию (Немцова М.В., Залетаев Д.В., Стрельников В.В Стрельников., Разрешение ФС № 2011/131 от 27.05.2011 г.). Секвенирование и фрагментный анализ ДНК производили по протоколам фирмы-производителя оборудования и реактивов («Applied Biosystems», США). Протоколы скрининга дифференциального метилирования ДНК разработаны без помощи других в соавторстве с Стрельников сотрудниками лаборатории эпигенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН (Кузнецова с соавт., 2004; Стрельников с соавт., 2009).

^ Программное обеспечение планирования и анализа результатов тестов.

Дизайн олигонуклеотидных праймеров для ПЦР проводили с внедрением на публике доступных программ OLIGO (Rychlik Стрельников, Rhoads, 1989), Methprimer (Li, Dahiya, 2002), Methyl Primer Express («Applied Biosystems», США). Визуализацию и анализ электрофореграмм капиллярного электрофореза обеспечивали без помощи других разработанными и зарегистрированными компьютерными программками PeakPick и AIMS in silico Стрельников (Танас А.С., Руденко В.В., Стрельников В.В.; регистрационные номера ВНТИЦ 50201050040 от 2010 г., и 50201151514 от 2011 г.). Планирование тестов и характеристику репрезентаций метиломов проводили с внедрением программки AIMS in silico.


^ III. РЕЗУЛЬТАТЫ И Стрельников ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

В итоге проведенного исследования разработана уникальная методология скрининга дифференциального метилирования ДНК, проведена удачная апробация новых способов на материале клеточных линий рака молочной железы (РМЖ), после этого проанализированы репрезентации метиломов Стрельников РМЖ, рака почки (РП), рака мочевого пузыря (РМП), немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), В-клеточного острого лимфобластного лейкоза (В-ОЛЛ), обычных лимфоцитов периферической крови и буккального эпителия и выявлены соответствующие метилотипы, также новые Стрельников гены и локусы, дифференциально и повсевременно метилированные в исследованных материалах. Проведен анализ состояния метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе зависимо от локальных параметров хроматина и предложена догадка, связывающая эти свойства.

На базе Стрельников приобретенных результатов был сформирован синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез, на базе локальных черт генома в норме и при злокачественной трансформации. На оканчивающем Стрельников шаге исследования была проведена апробация разработанного синтетического подхода на модели семейства генов, вовлеченных в канцерогенез (генов субъединиц ламининов), показавшая высочайший предиктивный потенциал способа.

В области исследования дифференциального метилирования геномов нами Стрельников разработана методология как тенденциозного, так и непредвзятого скрининга. Тенденциозные подходы предполагают отбор локусов для исследования на основании той либо другой догадки, предсказывающей более возможное выявление дифференциального метилирования конкретно этих локусов. Непредвзятый скрининг, напротив, подразумевает Стрельников определение дифференциального метилирования заблаговременно неведомых локусов генома с следующей идентификацией их нуклеотидных последовательностей. Непредвзятый скрининг отлично выявляет дифференциальное метилирование геномных участков, которые, в силу недостаточной изученности эпигеномов, не подпадают под известные Стрельников догадки и не врубаются в анализ способами первой группы (Fraga M.F., Esteller M., 2002).


^ 3.1. Непредвзятый скрининг дифференциального метилирования геномов

Непредвзятый скрининг не только лишь расширяет фундаментальные представления о роли метилирования ДНК в норме Стрельников и при патологии, да и содействует диверсификации основ разработки эпигенетических исследовательских маркеров. Непредвзятость скрининга - краеугольный камень беспристрастной оценки состояния изучаемых метиломов (Schumacher A. et al., 2006, Gebhard C. et al., 2006). В то же время Стрельников рационального способа непредвзятого скрининга дифференциального метилирования на сегодня не существует (Bock C., 2009). Была поставлена задачка разработки такового способа и приняты за базу технологии метилчувствительного фингерпринтинга (МЧФП) и амплификации интерметилированных веб-сайтов (АИМС Стрельников).


^ Оптимизация способа МЧФП

Способ МЧФП разработан независимо от других создателей (более ранешний из размещенных аналогов – MS-AP-PCR, methylation-sensitive arbitrarily primed PCR, Gonzalgo M.L. et al., 1997). Предложенный вариант отличается от «классического» и Стрельников, так как он размещен позже (Дрозд О.В., Стрельников В.В., Немцова М.В., Залетаев Д.В., 2002), получил заглавие «оптимизированного способа МЧФП».

МЧФП представляет собой один из более приятных методов Стрельников визуализации дифференциально метилированных CpG-островков в составе разных геномов. Принципная схема способа представлена на рис. 1.







Рис. 1. Схема способа МЧФП. Голубым цветом обозначены C,G-богатые участки геномной ДНК, оранжевым – праймеры. Понизу справа - пример визуализации Стрельников товаров МЧФП в геле методом расцветки нитратом серебра. 1, 2, 3 – эталоны РМЖ, М – маркер молекулярной массы; стрелкой указан кусок, дифференциально метилированный в представленных образчиках.

Для проведения анализа эталоны ДНК подвергаются поэтапному гидролизу Стрельников. На первом шаге ДНК гидролизуется частощепящей рестриктазой RsaI, веб-сайт узнавания которой не содержит нуклеотидов C и G, с целью уменьшения размера фрагментов для предстоящей амплификации и обогащения образцов фракцией CpG-островков. Аликвоты приобретенных Стрельников рестриктов подвергаются параллельному гидролизу чувствительным и нечувствительным к метилированию изошизомерами HpaII и MspI, имеющими веб-сайт узнавания CCGG.

Полимеразная цепная реакция с вырожденными C,G-богатыми праймерами проводится для Стрельников каждой из групп рестриктов RsaI, RsaI+MspI, RsaI+HpaII при мягеньких критериях (низкая температура отжига). В итоге амплификации рестриктов RsaI формируется пул CG-богатых фрагментов. Амплификация проб, подвергнутых обработке RsaI и нечувствительным к метилированию Стрельников ферментом MspI, позволяет найти наличие веб-сайта узнавания CCGG, при существовании которого происходит разрыв матрицы меж праймерами и ПЦР-продукт не находится. В конце концов, амплификация рестриктов RsaI+HpaII позволяет проанализировать Стрельников состояние метилирования куска ДНК. Если внутренний CpG-динуклеотид в веб-сайте узнавания неметилирован, кусок гидролизуется метилчувствительной рестриктазой и ПЦР-продукт отсутствует. В случае метилирования веб-сайта матрица остается интактной и продукт Стрельников амплификации детектируется в геле (Gonzalgo M.L. et al., 1997; Кузнецова Е.Б., Стрельников В.В., 2006).

В традиционном варианте способа МЧФП применяется ПЦР с радиоактивно мечеными праймерами с следующей радиоавтографией денатурирующих гелей с низкой концентрацией Стрельников акриламида. Таковой подход значит неприемлемую в современных лабораторных критериях токсичность, высочайшие вещественные и временные издержки, неоправданную трудозатратность исследования.

Секвенирование фрагментов МЧФП опосредуется трудозатратной и многоэтапной процедурой клонирования ПЦР-продуктов, изоляция Стрельников которых из геля происходит в отсутствие способности конкретного зрительного контроля процесса. Этот блок протокола МЧФП просит изменены, лучше, прямым секвенированием с праймеров, использующихся при постановке МЧФП. Нужно также обеспечить конкретный зрительный контроль Стрельников за изоляцией интересующих фрагментов, также уменьшить просвет времени от анализа геля и выявления фрагментов до их реамплификации, что должно содействовать сохранению целостности ДНК.

В разработанном оптимизированном варианте способа процедура клонирования фрагментов ДНК, извлеченных из геля Стрельников, заменена конкретным прямым секвенированием с праймеров, использующихся при постановке МЧФП. Основная неувязка при всем этом состоит в том, что даже при использовании в МЧФП пары различных праймеров продукт амплификации с высочайшей Стрельников вероятностью может быть фланкирован только одним из их. Решение основано на том, что все интересующие продукты МЧФП содержат, по последней мере, один веб-сайт узнавания рестриктазы MspI, так как конкретно по этому признаку Стрельников и делается их селекция. Гидролиз товаров реамплификации фрагментов, элюированных из геля, этим ферментом приводит к образованию фрагментов различной длины, два из которых оканчиваются последовательностями, гомологичными праймеру. Секвенирование консистенции рестриктов с Стрельников этого праймера в подавляющем большинстве случаев приводит к получению информативной нуклеотидной последовательности, довольно протяженной для конкретной идентификации искомого участка генома.


Критика главных недочетов традиционного варианта МЧФП в сравнении с предложенными усовершенствованиями Стрельников на каждом из шагов представлены в табл. 1.


Таблица 1. Недочеты традиционного МЧФП и методы оптимизации способа.

^ Шаг протокола

Недочеты традиционного МЧФП

Механизмы оптимизации способа

Фракциониро-вание

товаров МЧФП

Фракционирование в денатурирующих гелях низкой плотности (понижение сохранности фрагментов ПЦР, увеличение трудозатратности Стрельников процессов)

Разработка протокола фракционирования товаров МЧФП в неденатурирующих гелях средней плотности (8% акриламида)

Визуализация товаров

МЧФП

Внедрение в ПЦР радиоактивно меченых праймеров (токсичность, высочайшие вещественные и временные издержки)



Разработка протокола детекции ПЦР Стрельников-продуктов, приобретенных с немеченых праймеров, с визуализацией фрагментов ДНК конкретно в геле – расцветка неденатурирующих гелей средней плотности нитратом серебра.

Детекция сигналов способом радиоавтографии (временные издержки, пространственное разделение носителя био материала – геля – и Стрельников носителя зрительной инфы – радиоавтографа)

Подготовка к секвенированию товаров МЧФП

Клонирование фрагментов ДНК (многоэтапный процесс, требующий неоправданных издержек времени, расходных материалов и оборудования)

Реамплификация ПЦР-продуктов с праймеров, использованных для МЧФП, после подготовительного Стрельников определения специфичных фланков товаров МЧФП.


^ Состав репрезентаций генома, генерируемых способом МЧФП

С внедрением разработанной модификации способа МЧФП проанализировано 40 парных (норма + опухоль) образцов ДНК нездоровых РМЖ и выявлено 43 куска, содержащих, по последней мере, один Стрельников веб-сайт узнавания рестриктазы MspI. Посреди этих фрагментов 25(58%) были метилированы и 11(26%) неметилированы во всех образчиках. Для 7(16%) фрагментов было показано дифференциальное метилирование, по последней мере, в одной из пар образцов. Эффективность выявления Стрельников дифференциально метилированных фрагментов ДНК при помощи разработанной модификации способа сравнима с плодами, приобретенными другими создателями. Так в работе Liang, основанной на применении способа МЧФП (Gonzalgo M.L. et al., 1997), дифференциально метилированные куски составили 13,5% от полного Стрельников количества приобретенных фрагментов (Liang G. et al, 1998). Высочайшая эффективность нашего способа гласит об успешном дизайне последовательностей праймеров, избранных для опыта, и об адекватности разрешающей возможности используемого метода разделения репрезентаций Стрельников МЧФП.

Результаты прямого секвенирования выявленных дифференциально метилированных фрагментов позволили провести компьютерный анализ их последовательности, на основании которого они были идентифицированы как участки CpG-островков генов LAMC3, ^ SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и Стрельников PSMF1. Аномальное метилирование обозначенных CpG-островков при РМЖ продемонстрировано в первый раз. Из перечисленных генов только для 1-го, супрессора опухолевого роста BIN1, подтверждено роль в канцерогенезе (Ge R. et al., 1999), в то время Стрельников как целенаправленного исследования роли молекулярной патологии других генов при раке не проводилось.

Приобретенные результаты демонстрируют, что оптимизированный способ МЧФП позволяет отлично выявлять новые гены, подвергающиеся аномальному метилированию при канцерогенезе. В то же Стрельников время, в самой природе МЧФП заложен ряд принципно неискоренимых недочетов. А именно, как было показано, продукты МЧФП, надлежащие дифференциально метилированным участкам генома, составляют в среднем менее 15% всех товаров реакции, содержащих веб Стрельников-сайты узнавания рестриктазы MspI. На фоне же общей репрезентации толика дифференциально метилированных фрагментов не превосходит единичных процентов. Таким макаром, область разделения частей репрезентации МЧФП занята в главном неинформативными элементами, толика которых может превосходить Стрельников 95%. 2-ой системный недочет МЧФП – внедрение статистических праймеров, не допускающее ни мельчайшей стандартизации способа.

К началу 2000-х гг. назрела необходимость разработки подхода к скринингу дифференциального метилирования геномов, не уступающего по эффективности МЧФП и лишенного Стрельников присущих ему недочетов. В 2002 году такая разработка, основанная на адаптер-опосредованной амплификации интерметилированных веб-сайтов (АИМС), была размещена испанскими исследователями (Frigola J. et al., 2002).

Проведен критичный анализ способа АИМС, результатом которого практически Стрельников стало создание не просто измененного способа АИМС, а принципно новейшей технологии анализа длин амплифицируемых фрагментов – AFLOAT (Amplified Fragment Length Oriented Analysis Technique), которая может употребляться как для исследования дифференциального метилирования Стрельников ДНК, так и в более широких геномных приложениях.


^ Разработка необычного метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов: разработка AFLOAT

Биотехнологической основой разработки новейшей технологии стал способ АИМС (Frigola J. et al., 2002), представленный на рис Стрельников. 2. На первом шаге ДНК обрабатывают метилчувствительной рестриктазой SmаI (веб-сайт узнавания ССС/GGG), которая оставляет куски с «тупыми» концами. Метилированные гексануклеотиды СССGGG, оставшиеся интактными, потом расщепляются рестриктазой ХmаI (веб-сайт узнавания C/CCGGG Стрельников), формирующей куски с «липкими» концами. Последние способны вести взаимодействие с адаптерами в реакции лигирования и амплифицироваться в следующей ПЦР. ПЦР всей совокупы лигированных фрагментов проводится с радиоактивно меченых праймеров, в целом гомологичных Стрельников адаптеру, но удлиненных на 1-4 случаем избранных нуклеотида, составляющих удлинитель универсального праймера. Последующие манипуляции подобны таким, производимым при МЧФП для визуализации и секвенирования дифференциально метилированных фрагментов. Регуляция количества товаров ПЦР осуществляется методом подбора Стрельников длины и состава удлинителя универсального праймера. На теоретическом уровне, исходя из представленности нуклеотидов в геноме человека, добавление каждого следующего понижает количество товаров реакции приблизительно в 5 раз для C,G и в Стрельников 3 раза для A,T. Подбор рационального размера репрезентации обеспечивает не плохое разделение и высшую информативность бэндов на радиоавтографах и упрощает изоляцию интересующих CpG-островков (Frigola J. et al., 2002).




Рис. 2. Схема способа амплификации интерметилированных Стрельников веб-сайтов. Сплошная линия изображает участок геномной ДНК, содержащий семь веб-сайтов CCCGGG. Неметилированные веб-сайты обозначены голубым цветом, метилированные – красноватым, адаптеры – зеленоватым. Радиоавтографы полиакриламидных гелей (ПААГ) иллюстрируют фингерпринты, приобретенные с внедрением Стрельников праймеров, удлиненных на 1-3 нуклеотида. Схема приспособлена из публикации Frigola J. с соавт. (2002), приводится по источнику: Стрельников В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. в учебнике "Системы генетических и эпигенетических маркеров в Стрельников диагностике онкологических новообразований", 2009. С. 83.


Проведен критичный анализ способа АИМС для каждого из технологических шагов, в принципе характерных хоть какому способу скрининга дифференциального метилирования геномов: подготовки геномных репрезентаций, их редукции, разделения Стрельников частей репрезентаций, визуализации частей репрезентаций, определения их геномной принадлежности, сопоставления репрезентаций.

На шаге подготовки геномных репрезентаций употребляются метилчувствительные рестриктазы (напр., SmaI, HpaII) и их нечувствительные к метилированию изошизомеры (XmaI, MspI, соответственно). Не исключено Стрельников, что этот технологический шаг можно улучшить на уровне планирования набора рестриктаз на базе математического моделирования результатов АИМС, которое могло бы показать ряд количественных и высококачественных черт репрезентаций, получаемых при работе с тем либо Стрельников другим геномом.

^ Редукция геномных репрезентаций в способе АИМС осуществляется 2-мя методами. Во-1-х, это выбор применяемых рестриктаз: гидролиз геномной ДНК более частощепящими ферментами приводит к формированию более презентабельных репрезентаций. Во-2-х Стрельников, на шаге ПЦР могут употребляться удлинители универсальных праймеров, снижающие мощность репрезентации, при этом с повышением длины удлинителя репрезентативность падает. Оба метода редукции употребляются в текущее время, но определение их рационального соотношения остается эмпирическим Стрельников (Esteller M., 2005). Оптимизация на этом шаге должна заключаться в разработке инструмента моделирования результатов АИМС при использовании разных методов редукции с целью получения репрезентаций, обеспечивающих лучшие способности их анализа на следующих шагах Стрельников.

На шагах визуализации и определения геномной принадлежности товаров реакции задачи реализации АИМС схожи таким, описанным выше для МЧФП. Для способа, генерирующего такое существенное количество мотивированных фрагментов ДНК, как АИМС шаг разделения должен быть Стрельников реализован на платформе, обеспечивающей более высочайшее разрешение фрагментов ДНК. Такая платформа представлена на сегодня капиллярным электрофорезом (КЭФ) в формате фрагментного анализа. Предложен метод дискриминации товаров АИМС, синтезированных с флуоресцентно меченых Стрельников праймеров, при помощи КЭФ, который существенно увеличивает разрешающую способность способа, устраняет от необходимости использования радиоактивно меченых материалов, уменьшает время получения результатов анализа эталона. Данные КЭФ представлены в цифровом виде, что позволяет применить средства цифровой обработки Стрельников сигналов для сопоставления репрезентаций.

Высочайшая разрешающая способность капиллярного электрофореза в купе с компьютерным обеспечением анализа результатов обеспечивают высокоточное определение длин выявляемых дифференциально метилированных фрагментов генома. Такая информация может употребляться для Стрельников определения геномной принадлежности интересующих фрагментов методом сопоставления с виртуальными представлениями репрезентаций геномов, что исключает этапы физической изоляции их из геля, клонирования и секвенирования, снижая, тем, временные издержки, трудоёмкость и ресурсоёмкость исследования.

Сочетание преимуществ Стрельников платформы АИМС, капиллярного электрофореза и математического анализа с современными способностями биоинформатики позволяют сформировать блок-схему современного способа непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов (рис. 3). Было показано, что избранный за базу разработки способ АИМС Стрельников просит модификации каждого из главных шагов воплощения скрининга, при этом многие модификации осуществимы только с применением способов биоинформатики и математического моделирования.





Рис. 3. Блок-схема способа непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов Стрельников на базе технологии анализа длин амплифицируемых фрагментов – AFLOAT. Указаны главные нужные модификации обычных подходов.


Для обеспечения обоснованного дизайна тестов АИМС методом подготовительного моделирования ожидаемых результатов разработана программка компьютерной симуляции «AIMS in silico Стрельников». Метод работы программки заключается в последующем. На первом шаге моделируется полный набор фрагментов ДНК, получаемых при обработке исследуемого генома основной рестриктазой АИМС (в традиционном варианте это – XmaI). Практически этот набор - полная репрезентация АИМС, представляющая собой Стрельников субстрат для последующих исследовательских работ in silico с целью моделирования вероятных результатов АИМС в реальном опыте при разных удлинителях универсального праймера. В предстоящем полная репрезентация виртуально подвергается лигированию с предложенным юзером адаптером Стрельников и амплифицируется с универсальным праймером, содержащим данный удлинитель. Таким макаром, метод моделирования результатов тестов фактически воспроизводит протокол воплощения АИМС in vitro. С внедрением разработанной компьютерной программки охарактеризован состав репрезентаций генома, генерируемых способом Стрельников АИМС. Количественная иерархия товаров зависимо от длин и нуклеотидного состава удлинителей универсальных праймеров представлена в виде гистограммы на рис. 4. Гистограмма ясно показывает неточность постулата создателей способа АИМС о том, что Стрельников при иных равных критериях добавление каждого дополнительного нуклеотида к универсальным праймерам подразумевает понижение трудности результирующей картины в 5 раз для C,G и в 3 раза для A,T. Принципиально, что экспериментальное определение характеристик, представленных на Стрельников рис. 4, потребовало бы неописуемых издержек труда, времени и материалов, а неопределение наверное привело бы к неверной интерпретации опытнейших данных.



strategiya-rossii-v-latinskoj-amerikoj.html
strategiya-selskohozyajstvennogo-marketinga.html
strategiya-socialno-ekonomicheskogo-razvitiya-municipalnogo-obrazovaniya-gorod-pokachi-na-period-do-2020-goda-stranica-31.html